Один ген один фермент современная трактовка. Экспрессия генов в процессе биосинтеза белка. Регуляция экспрессии генов у про- и эукариот. Гипотеза «один ген — один фермент», ее современная трактовка. PS4 стартовала, Xbox One на подходе: один на один или дв

4.2.1. Гипотеза «один ген – один фермент»

Первые исследования. После того как в 1902 г. Гэррод указал на связь генетического дефекта при алкаптонурии с неспособностью организма расщеплять гомогентизиновую кислоту, важно было выяснить специфический механизм, лежащий в основе этого нарушения. Поскольку тогда уже было известно, что метаболические реакции катализируются ферментами, можно было предположить, что именно нарушение какого-то фермента приводит к алкаптонурии. Такая гипотеза обсуждалась Дришем (в 1896 г.). Ее высказывали также Холдейн (1920 г., см. ) и Гэррод (1923 г. ). Важными этапами в развитии биохимической генетики стали работы Кюхна и Бутенандта по изучению окраски глаз у мельничной огневки Ephestia kuhniella и аналогичные исследования Бидла и Эфрусси на Drosophila (1936) . В этих пионерских работах для выяснения механизмов действия генов были выбраны мутанты насекомых, изученные ранее генетическими методами. Однако такой подход не привел к успеху. Проблема оказалась слишком сложной, и чтобы решить ее, необходимо было:

1) подобрать простой модельный организм, удобный для экспериментального изучения;

2) искать генетическую основу биохимических признаков, а не биохимическую основу генетически детерминированных признаков. Оба условия были выполнены в работе Бидла и Татума в 1941 году (см. также Бидл, 1945 ).

Модель Бидла и Татума. Статья этих исследователей начиналась так:

«С точки зрения физиологической генетики - развитие и функционирование организма может быть сведено к сложной системе химических реакций, которые каким-то образом контролируются генами. Вполне логично предположить, что эти гены... либо сами выступают в роли ферментов, либо определяют их специфичность. Известно, что генетики-физиологи обычно пытаются исследовать физиологические и биохимические основы уже известных наследственных признаков. Этот подход позволил установить, что многие биохимические реакции контролируются специфическими генами. Такие исследования показали, что ферменты и гены обладают специфичностью одного порядка. Однако возможности этого подхода ограниченны. Наиболее серьезное ограничение заключается в том, что при этом в поле зрения исследователей попадают наследственные признаки, не имеющие летального эффекта и, следовательно, связанные с реакциями, которые не очень существенны для жизнедеятельности организма. Второе затруднение... заключается в том, что традиционный подход к проблеме подразумевает использование внешне проявляющихся признаков. Многие из них представляют собой морфологические вариации, основанные на системах биохимических реакций, настолько сложных, что их анализ необычайно затруднен.

Подобные соображения привели нас к следующему выводу. Изучение общей проблемы генетического контроля биохимических реакций, определяющих развитие и метаболизм, должно проводиться с помощью процедуры, противоположной общепринятой: вместо того чтобы пытаться выяснить химические основы известных наследственных признаков, необходимо установить, обеспечивают ли гены контроль известных биохимических реакций и как они это делают. Нейроспора, относящаяся к аскомицетам, обладает свойствами, позволяющими реализовать такой подход и одновременно служит удобным объектом для генетических исследований. Вот почему наша программа была построена на использовании именно этого организма. Мы исходили из того, что облучение рентгеном вызывает мутации в генах, контролирующих определенные химические реакции. Пусть для выживания в данной среде организм должен осуществлять какую-то химическую реакцию, тогда мутант, лишенный такой способности, в этих условиях окажется нежизнеспособным. Однако его можно поддерживать и изучать, если выращивать в среде, к которой добавлен жизненно необходимый продукт генетически блокированной реакции».

4 Действие генов 9

Рис. 4.1. Схема эксперимента по обнаружению биохимических мутантов нейроспоры На полноценной среде мутации, индуцированные рентгеновскими лучами или ультрафиолетом, не нарушают роста гриба. Однако на минимальной среде мутант не растет. При добавлении к минимальной среде витаминов способность к росту восстанавливается При внесении аминокислот роста нет На основании этих данных можно предположить, что мутация произошла в гене, который контролирует метаболизм витамина Следующий шаг заключается в идентификации витамина, способного восстановить нормальную функцию Генетический блок обнаружен среди реакций биосинтеза витамина .

Далее Бидл и Татум приводят описание схемы эксперимента (рис. 4.1). В состав полной среды входил агар, неорганические соли, солодовый экстракт, дрожжевой экстракт и глюкоза. Минимальная среда содержала только агар, соли, биотин и источник углерода. Наиболее подробно были исследованы мутанты, которые росли на полной среде и не росли на минимальной. Чтобы установить соединение, синтез которого нарушен у каждого из мутантов, в минимальный агар вносили отдельные компоненты полной среды.

Таким способом были выделены штаммы, неспособные синтезировать определенные факторы роста: пиридоксин, тиамин и парааминобензойную кислоту. Было показано, что эти дефекты обусловлены мутациями в специфических локусах. Работа положила начало многочисленным исследованиям на нейроспоре, бактериях и дрожжах, в которых было установлено соответствие «генетических блоков», ответственных за отдельные метаболические этапы, и специфических нарушений ферментов. Этот подход очень быстро превратился в инструмент, позволяющий исследователям раскрывать метаболические пути.

Гипотеза «один ген - один фермент» получила прочное экспериментальное подтверждение. Как показали работы последующих десятилетий, она оказалась удивительно плодотворной. Анализ дефектных ферментов и их нормальных вариантов позволил вскоре выявить такой класс генетических нарушений, которые приводили к изменению функции фермента, хотя сам белок по-прежнему обнаруживался и сохранял иммунологические свойства. В других случаях менялся температурный оптимум активности фермента. Некоторые варианты можно было объяснить мутацией, влияющей на общий регуляторный механизм и изменяющей в результате активность целой группы ферментов. Подобные исследования привели к созданию концепции регуляции активности генов у бактерий, которая включала и концепцию оперона.

10 4. Действие генов

Первые примеры ферментативных нарушений у человека. Первым наследственным заболеванием человека, для которого удалось показать ферментативное нарушение, была метгемоглобинемия с рецессивным типом наследования (Гибсон и Харрисон, 1947 ; Гибсон, 1948 ) (25080). В этом случае поврежденным ферментом является NADH - зависимая метгемоглобин-редуктаза. Первая попытка систематического изучения группы заболеваний человека, связанных с дефектами метаболизма, была предпринята в 1951 году. При исследовании болезни накопления гликогена супруги Кори показали, что в восьми из десяти случаев патологического состояния, которое диагностировалось как болезнь Гирке (23220), структура гликогена печени представляла собой нормальный вариант, а в двух случаях была явно нарушена. Было также очевидно, что гликоген печени, накапливаясь в избытке, не может быть непосредственно превращен в сахар, поскольку у больных проявляется тенденция к гипогликемии. Для расщепления гликогена с образованием глюкозы в печени необходимы многие ферменты. Два из них-амило-1,6-глюкозидаза и глюкозо6-фосфатаза-были выбраны для изучения как возможные дефектные элементы ферментной системы. В гомогенатах печени при различных значениях рН было измерено освобождение фосфата из глюкозо-6фосфата. Результаты представлены на рис. 4.2. В нормальной печени обнаруживалась высокая активность с оптимумом при рН 6-7. Сильное нарушение функции печени при циррозе коррелировало с незначительным уменьшением активности. С другой стороны, в случае болезни Гирке с летальным исходом, активность фермента обнаружить вообще не удалось; такой же результат был получен при обследовании второго подобного больного. У двух пациентов с менее выраженными симптомами наблюдалось значительное уменьшение активности.

Было сделано заключение, что в указанных случаях болезни Гирке с летальным исходом имел место дефект глюкозо-6-фосфатазы. Однако в большинстве более легких случаев активность этого фермента оказалась не ниже, чем при циррозе печени, и только у двух больных она была несколько меньшей (рис. 4.2).

По мнению супругов Кори, аномальное накопление гликогена в мышечной ткани нельзя связывать с недостатком глюкозо-6-фосфатазы, поскольку в мышцах этот фермент отсутствует и в норме. В качестве возможного объяснения гликогеноза мышц они предположили нарушение активности амило-1,6-глюкозидазы. Это предсказание вскоре подтвердилось: Форбс обнаружил такой дефект при одном из клинически выраженных случаев болезни накопления гликогена с вовлечением сердечной и скелетных мышц. Сейчас нам

4. Действие генов 11

известно большое число ферментативных дефектов при болезни накопления гликогена .

Хотя по степени проявления различные формы этого заболевания несколько различаются, в клиническом отношении между ними много общего. За одним исключением, все они наследуются по аутосомнорецессивному типу. Если бы ферментативные дефекты не были раскрыты, патология накопления гликогена рассматривалась бы как одно заболевание с характерными внутрисемейными корреляциями по тяжести течения, деталям симптоматики и срокам летального исхода. Таким образом, перед нами пример, когда генетическая гетерогенность, которую можно было лишь предполагать на основании изучения фенотипа (разд. 3.3.5), подтвердилась при анализе на биохимическом уровне: исследование ферментативной активности позволило идентифицировать специфические гены.

В последующие годы темп исследований в области ферментативных дефектов нарастал, и для 588 идентифицированных рецессивных аутосомных генов, которые Мак-Кьюсик описывает в шестом издании своей книги «Менделевское наследование у человека» (1983) , более чем в 170 случаях обнаружены специфические ферментативные нарушения. Наши успехи в этой области непосредственно связаны с развитием концепций и методов молекулярной генетики.

Некоторые этапы изучения ферментативных нарушений у человека. Мы приводим лишь наиболее важные вехи этого продолжающегося процесса: 1934 Фёллинг открыл фенилкетонурию

1941 Бидл и Татум сформулировали гипотезу «один ген - один фермент» 1948 Гибсон описал первый случай ферментативного нарушения при заболевании у человека (рецессивная метгемоглобинемия)

1952 Супруги Кори обнаружили недостаточность глюкозо-6-фосфатазы при болезни Гирке

1953 Джервис продемонстрировал отсутствие фенилаланингидроксилазы при фенилкетонурии . Бикель сообщил о первой попытке смягчить ферментативное нарушение, применив диету с низким содержанием фенилаланина

1955 Смитис разработал методику электрофореза в крахмальном геле

1956 Карсон и др. обнаружили дефект глюкозо-6-фосфат- дегидрогеназы (G6PD) в случае индуцированной гемолитической анемии

1957 Калькар и др. описали ферментативную недостаточность при галактоземии, показав, что у человека и бактерий наблюдается идентичное нарушение ферментативной активности

1961 Крут и Вайнберг продемонстрировали дефект фермента при галактоземии in vitro в культуре фибробластов

1967 Сигмиллер и др. обнаружили дефект гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (HPRT) при синдроме Леша -Найхана

1968 Кливер описал нарушение эксцизионной репарации при пигментной ксеродерме

1970 Нейфельд выявил ферментативные дефекты при мукополисахаридозах, что позволило идентифицировать пути расщепления мукополисахаридов

1974 Браун и Голдстейн доказали, что генетически детерминированная суперпродукция гидроксиметилглютарилСоА-редуктазы при семейной гиперхолестеринемии обусловлена дефектом локализованного в мембране рецептора липопротеинов низкой плотности, который модулирует активность этого фермента (HMG)

1977 Слай и др. продемонстрировали, что маннозо-6-фосфат (как компонент лизосомальных ферментов) узнается рецепторами фибробластов. Генетический дефект процессинга препятствует связыванию лизосомных ферментов, в результате нарушается их выход в цитоплазму и последующая секреция в плазму (I-клеточная болезнь)

12 4. Действие генов

1980 При псевдогипопаратиреозе обнаружен дефект белка, обеспечивающего сопряжение рецептора и циклазы.

Генетика - наука отнюдь не молодая, исследования в ней ведутся на протяжении нескольких столетий, начиная с Менделя в 1865 г. и до наших дней. Термин «ген» для обозначения единицы наследственной характеристики впервые предложил Johannsen в 1911 г., а в 1940-е годы был уточнен концепцией «один ген - один фермент», которую предложили Tatum и Beadle.

Это положение определено в экспериментах на мухах-дрозофилах, но в равной степени распространяется и па человека; в конечном итоге жизнь всех существ определяется их ДНК. Молекула ДНК у человека больше, чем у всех остальных организмов, и она устроена сложнее, но суть ее функций одинакова у всех живых существ.

Концепция «один ген - один фермент », возникшая на основе идей Tatum и Beadle, может быть сформулирована следующим образом:
1. Все биологические процессы находятся под генетическим контролем.
2. Все биохимические процессы происходят в виде поэтапных реакций.
3. Каждая биохимическая реакция в конечном счете находится под контролем различных отдельных генов.
4. Мутация в определенном гене ведет к изменению способности клетки к осуществлению определенной химической реакции.

С тех пор концепция «один ген - один фермент» несколько расширилась, и звучит теперь как «один ген - один белок ». Кроме того, последние исследования свидетельствуют, что некоторые гены действуют в содружестве с другими, в результате чего образуются уникальные белки, т. е. некоторые гены могут кодировать более одного белка.

Геном человека содержит около 3 млрд нуклеотидных пар; полагают, что в нем содержится от 50 000 до 100 000 . После расшифровки генома выяснилось, что генов всего около 30 000. Взаимодействие этих генов гораздо сложнее, чем предполагалось. Гены зашифрованы в нитях ДНК, которые в комплексе с определенными ядерными белками формируют хромосомы.

Гены - не просто отрезки ДНК: их образуют кодирующие последовательности - экзоны, перемежающиеся с некодирующими последовательностями - нитронами. Экзоны как экспрессирующаяся часть ДНК составляют лишь малую часть самой главной молекулы организма; большая часть ее не экспрессируется, образована нитронами и часто называется «молчащей» ДНК.

Примерные размер и структура человеческого генома представлены на рисунке ниже. Функциональная длина человеческой хромосомы выражается в сантиморганидах. Сантиморганида (сМ) - расстояние, на протяжении которого вероятность кроссинговера в течение мейоза составляет 1 %. Анализ сцепления генов показал, что продолжительность человеческого генома около 3000 сМ.

Средняя хромосома содержит примерно 1500 генов, зашифрованных в 130 млн пар нуклеотидных оснований. На рисунке ниже схематически представлены физический и функциональный размеры генома: первый рассчитан в нуклеотидных парах, а второй - в сМ. Большая часть человеческого генома представлена «молчащей» ДНК и не экспрессируется.

На матрице ДНК в результате процесса транскрипции синтезируется РНК, а затем - белок. Следовательно, последовательность ДНК полностью определяет последовательность функциональных белков клетки. Все белки синтезируются следующим образом:
ДНК => РНК => белок

Генетический аппарат человека и других млекопитающих устроен сложнее, чем у остальных живых организмов, т. к. участки некоторых генов у млекопитающих могут объединяться с частями других генов , в результате чего синтезируется совершенно новый белок или контролируется отдельная клеточная функция.

Следовательно, у человека возможно повышение числа экспрессирующихся генов без действительного увеличения объема экспрессирующейся ДНК или абсолютного числа генов.
В целом около 70 % всего генетического материала не экспрессируются.

Открытия экзон-интронной организации эукариотических генов и возможности альтернативного сплайсинга показали, что одна и та же нуклеотидная последовательность первичного транскрипта может обеспечить синтез нескольких полипептидных цепей с разными функциями или их модифицированных аналогов. Например, в митохондриях дрожжей имеется ген box (или cob), кодирующий дыхательный фермент цитохром b. Он может существовать в двух формах (рис. 3.42). «Длинный» ген, состоящий из 6400 п. н., имеет 6 экзонов общей протяженностью 1155 п.н. и 5 интронов. Короткая форма гена состоит из 3300 п.н. и имеет 2 интрона. Она фактически представляет собой лишенный первых трех интронов «длинный» ген. Обе формы гена одинаково хорошо экспрессируются.

После удаления первого интрона «длинного» гена box на основе объединенной нуклеотидной последовательности двух первых экзонов и части нуклеотидов второго интрона образуется матрица для самостоятельного белка - РНК-матуразы (рис. 3.43). Функцией РНК-матуразы является обеспечение следующего этапа сплайсинга - удаление второго интрона из первичного транскрипта и в конечном счете образование матрицы для цитохрома b.

Другим примером может служить изменение схемы сплайсинга первичного транскрипта, кодирующего структуру молекул антител в лимфоцитах. Мембранная форма антител имеет на С-конце длинный «хвост» аминокислот, который обеспечивает фиксацию белка на мембране. У секретируемой формы антител такого хвоста нет, что объясняется удалением в ходе сплайсинга из первичного транскрипта кодирующих этот участок нуклеотидов.

У вирусов и бактерий описана ситуация, когда один ген может одновременно являться частью другого гена или некоторая нуклеотидная последовательность ДНК может быть составной частью двух разных перекрывающихся генов. Например, на физической карте генома фага ФХ174 (рис. 3.44) видно, что последовательность гена В располагается внутри гена А, а ген Е является частью последовательности гена D. Этой особенностью организации генома фага удалось объяснить существующее несоответствие между относительно небольшим его размером (он состоит из 5386 нуклеотидов) и числом аминокислотных остатков во всех синтезируемых белках, которое превышает теоретически допустимое при данной емкости генома. Возможность сборки разных пептидных цепей на мРНК, синтезированной с перекрывающихся генов (А и В или Е и D), обеспечивается наличием внутри этой мРНК участков связывания с рибосомами. Это позволяет начать трансляцию другого пептида с новой точки отсчета.

Нуклеотидная последовательность гена В является одновременно частью гена А, а ген Е составляет часть гена D

В геноме фага λ были также обнаружены перекрывающиеся гены, транслируемые как со сдвигом рамки, так и в той же рамке считывания. Предполагается также возможность транскрибирования двух разных мРНК с обеих комплементарных цепей одного участка ДНК. Это требует наличия промоторных областей, .определяющих движение РНК-полимеразы в разных направлениях вдоль молекулы ДНК.

Описанные ситуации, свидетельствующие о допустимости считывания разной информации с одной и той же последовательности ДНК, позволяют предположить, что перекрывающиеся гены представляют собой довольно распространенный элемент организации генома вирусов и, возможно, прокариот. У эукариот прерывистость генов также обеспечивает возможность синтеза разнообразных пептидов на основе одной и той же последовательности ДНК.

Имея в виду все сказанное, необходимо внести поправку в определение гена. Очевидно, нельзя больше говорить о гене как о непрерывной последовательности ДНК, однозначно кодирующей определенный белок. По-видимому, в настоящее время наиболее приемлемой все же следует считать формулу «Один ген - один поли-пептид», хотя некоторые авторы предлагают ее переиначить: «Один полипептид - один ген». Во всяком случае, под термином ген надо понимать функциональную единицу наследственного материала, по химической природе являющуюся полинуклеотидом и определяющую возможность синтеза полипептидной цепи, тРНК или рРНК.

Один ген один фермент.

В 1940 г Дж. Бидл и Эдвард Татум использовали новый подход для изучения того, как гены обеспечивают метаболизм у более удобного объекта исследований – у микроскопического грибка Neurospora crassa.. Ими были получены мутации, у которых; отсутствовала активность того-или иного фермента метаболизма. А это приводило к тому, что мутантный гриб бьл не способен сам синтезировать определенный метаболит (например, аминокислоту лейцин) и мог жить только тогда, когда лейцин был добавлен в питательную среду. Сформулированная Дж.Бидлом и Э.Татумом теория "один ген - один фермент" - быстро получила широкое признание у генетиков, а сами они были награждены Нобелевской Премией.

Методы. селекции так называемых "биохимических мутаций", приводящих к нарушениям действия ферментов, обеспечивающих разные пути метаболизма, оказались очень плодотворными не только для науки, но и для практики. Сначала они привели к возникновению генетики и селекции промышленных микроорганизмов, а потом и к микробиологической промышленности, которая использует штаммы микроорганизмов, сверх продуцирующие такие стратегически важные вещества, как антибиотики, витамины, аминокислоты и др.. В основе принципов селекции и генной инженерии штаммов сверхпродуцентов лежит представление, что "один ген кодирует один фермент". И хотя это представление отлично практике приносит многомиллионные прибыли и спасает миллионы жизней (антибиотики) - оно не является окончательным. Один ген - это не только один фермент.

Открытия экзон-интронной организации эукариотических генов и возможности альтернативного сплайсинга показали, что одна и та же нуклеотидная последовательность первичного транскрипта может обеспечить синтез нескольких полипептидных цепей с разными функциями или их модифицированных аналогов. Например, в митохондриях дрожжей имеется ген box (или cob), кодирующий дыхательный фермент цитохром b. Он может существовать в двух формах: «Длинный» ген, состоящий из 6400 п. н., имеет 6 экзонов общей протяженностью 1155 п.н. и 5 интронов. Короткая форма гена состоит из 3300 п.н. и имеет 2 интрона. Она фактически представляет собой лишенный первых трех интронов «длинный» ген. Обе формы гена одинаково хорошо экспрессируются.