Образование двух цепей ДНК. Генетический код. ДНК: зацеплеления двух цепей Образец решения задач
Слабые связи , изображенные в виде пунктирных поперечных линий, соединяют цепи ДНК вместе. На рисунке видно, что каркас цепи ДНК состоит из чередующихся остатков фосфорной кислоты и дезоксирибозы, к которой сбоку присоединяются пуриновые и пиримидиновые основания. Слабые водородные связи (пунктирные линии) между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями соединяют две цепи ДНК друг с другом. Здесь важно отметить следующее.
1. Каждая молекула пуринового основания аденина на одной цепи ДНК всегда связывается с молекулой пиримидинового основания тимина на другой цепи.
2. Каждая молекула пуринового основания гуанина всегда связывается с молекулой пиримидинового основания цитозина.
Водородные связи очень слабые, поэтому две цепи ДНК могут с легкостью отделяться одна от другой, что многократно повторяется в процессе функционирования ДНК в клетке.
Значение ДНК заключается в том, что она посредством так называемого генетического кода определяет синтез разнообразных клеточных белков. При расхождении двух цепей ДНК пуриновые и пиримидиновые основания оказываются обращенными в одну сторону. Именно эти боковые группировки и составляют основу генетического кода.
Двойная спираль ДНК. Двойной спиральный каркас молекулы представлен остатками фосфорной кислоты и молекулами дезоксирибозы.Между двумя спиралями располагаются, соединяя их, пуриновые и пиримидиновые основания, составляющие генетический код.
Генетический код представляет собой последовательность триплетов азотистых оснований, в которой каждый триплет состоит из трех последовательных азотистых оснований, образующих кодон. Последовательность триплетов азотистых оснований в итоге определяет последовательность аминокислот в молекуле синтезируемого в клетке белка. Последовательность из трех этих триплетов отвечает за прикрепление к молекуле синтезируемого белка одной за другой трех аминокислот: пролина, серина и глутаминовой кислоты.
ДНК находится в клеточном ядре, а большинство клеточных реакций протекают в цитоплазме, поэтому должен существовать механизм, посредством которого гены могут контролировать эти реакции. Данный механизм заключается в том, что в клеточном ядре на основе ДНК синтезируется другая нуклеиновая кислота - РНК, которая также становится носителем генетического кода. Этот процесс получил название транскрипции. Через поры ядерной оболочки вновь синтезированная РНК переносится из ядра в цитоплазму, в которой на основе этой РНК происходит синтез белка.
Для синтеза РНК необходимо, чтобы две цепи ДНК на какое-то время разошлись, причем только одна из этих цепей будет использоваться в качестве матрицы для синтеза РНК. На основе каждого триплета ДНК образуется комплементарный триплет (кодон) РНК, последовательность которых, в свою очередь, определяет последовательность аминокислот в молекуле белка, синтезируемой в цитоплазме.
Основные структурные элементы ДНК . Основные структурные элементы РНК и ДНК почти одинаковы, за двумя исключениями: во-первых, вместо дезоксирибозы РНК содержит близкий по строению сахар - рибозу, имеющую дополнительный гидроксильный ион; во-вторых, вместо тимина в состав РНК входит другой пиримидин - урацил.
Образование нуклеотидов РНК . Образование нуклеотидов РНК из ее структурных элементов происходит точно так же, как образование нуклеотидов ДНК. В состав РНК также входят 4 нуклеотида, содержащие 4 азотистых основания: аденин, гуанин, цитозин и урацил. Еще раз подчеркнем, что вместо тимина РНК содержит урацил, а остальные азотистые основания у РНК и ДНК одинаковы.
Активация нуклеотидов РНК
. На следующей стадии синтеза РНК происходит активация ее нуклеотидов под действием фермента РНК-полимеразы. Этот процесс заключается в присоединении к каждому нуклеотиду двух дополнительных фосфатных группировок с образованием трифосфата. Два фосфата присоединяются к нуклеотиду за счет образования макроэргинеских фосфатных связей с использованием энергии АТФ.
В результате активации каждый нуклеотид
накапливает большое количество энергии, необходимой для присоединения его к растущей цепи РНК.
Основные структурные элементы ДНК.
Дезоксиаденозинмонофосфат, один из нуклеотидов, составляющих ДНК.
Символическое обозначение четырех нуклеотидов, составляющих ДНК.
Каждый нуклеотид состоит из остатка фосфорной кислоты (Ф), дезоксирибозы (Д)
и одного из четырех азотистых оснований: аденина (А), тимина (Т), гуанина (Г) или цитозина (Ц).
Схема расположения дезоксирибонуклеотидов в двойной цепи ДНК.
Зацепления двух цепей ДНК - процесс образования зацеплений цепей ДНК при ее циклизации . При замыкании пары или большего числа полимерных цепей они могут образовывать зацепления различных типов. В частности, зацепление образуют нити двойной спирали в кольцевой замкнутой форме ДНК (здесь двойная спираль ДНК будет рассматриваться, в основном, как единая полимерная цепь). Зацепленные молекулы ДНК довольно часто встречаются в природе и могут быть получены в лабораторных условиях. Зацепления двух цепей имеют, вообще говоря, бесконечно много топологически неэквивалентных типов. Понятие порядка зацепления однозначно характеризует только зацепления определенного класса, образующиеся в кольцевых замкнутых ДНК. Общая картина выглядит значительно сложнее.
При случайной циклизации полимерной цепи в растворе она может оказаться в различных топологических состояниях. В случае изолированных цепей, т.е. без учета образующихся зацеплений, этот вопрос о вероятности этих топологических состояний сводится к вероятности образования различных узлов при случайном замыкании. Если же учитывать вероятность зацеплений, следует прежде всего рассмотреть вопрос о вероятности образования зацепленного состояния (или незацепленного состояния) при случайном замыкании двух цепей с заданным расстоянием между их центрами масс, R ( Klenin K.V. ea, 1988 , Frank-Kamenetskii M.D. ea, 1975 , Вологодский А.В. и др., 1974a и Iwata K., 1983). Результаты таких расчетов для модели бесконечно тонкой цепи ( Klenin K.V. ea, 1988) приведены на . Различные кривые соответствуют разному числу сегментов в каждой из цепей (обе цепи предполагаются состоящими из одинакового числа сегментов): 1 - 20 сегментов, 2 - 40, 3 - 80 сегментов. Значительная вероятность образования зацеплений при малых R означает, что число состояний системы из двух незацепленных цепей существенно уменьшается при их сближении. В результате раствор незацепленных бесконечно тонких кольцевых полимерных цепей не будет идеальным. В нем возникает отталкивание между цепями, имеющее энтропийную природу. В статистической механике такое отталкивание принято количественно характеризовать вторым вириальным коэффициентом B ( Ландау Л. и Лифшиц Е.М., 1964). Значения B для раствора незацепленных колец можно рассчитать на основании данных на Рис. Вероятность образования зацепления двух цепей . Эти значения (см. Рис. Расчет второго вириального коэффициента) оказываются близкими к величине B, отвечающей сферическим непроницаемым друг для друга частицам, имеющим радиус, равный среднеквадратичному радиусу инерции замкнутой полимерной цепи ( Klenin K.V. ea, 1988). Таким образом, даже идеальные бесконечно тонкие замкнутые цепи должны испытывать сильное взаимное отталкивание, которое целиком обусловлено топологическими ограничениями.
Катенаны, т.е. зацепления молекул ДНК, были обнаружены в некоторых клетках ( Clayton D.A. and Vinograd J., 1967 , Hudson B. and Vinograd J., 1967). Пример топологической структуры с зацеплениями представляют собой гигантские сети из зацепленных кольцевых ДНК кинетопластов (см. обзор Borst P. and Hoeijmakers J.H.J., 1979). Эти сети включают в себя десятки тыяч кольцевых молекул ДНК, структура большей части которых идентична.
Основными методами изучения топологии двунитевой ДНК являются электронная микроскопия и электрофорез в геле. На обычной электронно - микроскопической фотографии ДНК, однако, довольно трудно анализировать топологию молекул, так как трудно судить о том, какая из нитей в точках их пересечения на подложке идет выше, а какая ниже. В значительной мере эту трудность удалось впервые преодолеть за счет связывания двойной спирали с белком recA ( Krasnow M.A. ea, 1983). При этом нить ДНК утолщается настолько, что структура пересечений сегментов ДНК на фотографиях хорошо просматривается. С другой стороны, зацепленные молекулы ДНК отличаются по подвижности в геле от незацепленных молекул, что позволяет разделять их при электрофорезе (смотри Wasserman S.A. and Cozzarelli N.R., 1986). Этот метод требует, естественно, специальной калибровки, так как заранее нельзя сказать, какое положение в геле должна занимать та или иная топологическая структура относительно незаузленной кольцевой формы ДНК. В настоящее время, однако, уже накоплен достаточно большой экспериментальный материал о подвижности различных топологических структур относительно незаузленных топоизомеров исследуемой ДНК. Естественно, что при исследовании этим методом зацепленных молекул ДНК они должны содержать однонитевые разрывы, так как иначе подвижность будет зависеть и от порядка зацепления нитей двойной спирали.
1. Одна из цепочек ДНК имеет последовательность нуклеотидов: АГТ АНД ГАТ АЦТ ЦГА ТТТ АЦГ... Какую последовательность нуклеотидов имеет вторая цепочка той же молекулы?
Решение. По принципу комплементарности достраиваем вторую цепочку (А-Т, Г-Ц). Она будет выглядеть так: ТЦА ТГГ ЦТА ТГА ГЦТ AAA ТГЦ...
2. Большая из двух цепей белка инсулина (так называемая цепь В) начинается со следующих аминокислот: фенилаланин-валин-аспарагин-глутаминовая кислота-гистидин-лейцин. Напишите последовательность нуклеотидов в начале участка молекулы ДНК, хранящего информацию об этом белке.
Решение. Поскольку одну аминокислоту могут кодировать несколько триплетов, точную структуру иРНК и участка ДНК определить невозможно, структура может варьировать. Используя принцип комплементарности нуклеотидов и таблицу генетического кода получаем один из вариантов:
3. Участок гена имеет следующее строение, состоящее из последовательности нуклеотидов: ЦГГ ЦГЦ ТЦА AAA ТЦГ... . Укажите строение соответствующего участка белка, информация о котором содержится в данном гене. Как отразится на строении белка удаление из гена четвертого нуклеотида?
Решение. Используя принцип комплементарности соединения оснований водородными связями и таблицу генетического кода, делаем все как в предыдущей задаче:
|
Цепь ДНК |
ЦГГ |
ЦГЦ |
ТЦА |
ТЦГ |
|
|
ИРНК |
ЩЦ |
ГЦГ |
АТУ |
УУУ |
АГЦ |
|
Аминокислоты цепи белка |
Ала - Ала - Сер - Фен - Сер |
||||
При удалении из гена четвертого нуклеотида - Ц произойдут заметные изменения - уменьшится количество и состав аминокислот в белке:
|
Цепь ДНК |
ЦГГ |
Гцт |
ЦАА |
ААТ |
ЦГ |
|
ИРНК |
ЩЦ |
ЦГА |
ГУУ |
УУА |
ГЦ |
|
Аминокислоты цепи белка |
Ала - Apr - Вал - Лей - |
||||
4. При синдроме Фанкони (нарушение образования костной ткани) у больного с мочой выделяются аминокислоты, которым соответствуют кодоны в иРНК: АУА, ГУЦ, АУГ, УЦА, УУГ, ГУУ, АУУ. Определите, выделение каких аминокислот с мочой характерно для синдрома Фанкони, если у здорового человека в моче содержатся аминокислоты аланин, серии, глутаминовая кислота и глицин.
Решение. Используя таблицу генетического кода, определим аминокислоты, которые кодируются указанными триплетами. Это изолейцин, валин, метионин, серии, лейцин, тирозин, валин, изолейцин. Таким образом, в моче больного только одна аминокислота (серии) такая же как у здорового человека, остальные шесть - новые, а три, характерные для здорового человека, отсутствуют.
5. Исследования показали, что в иРНК содержится 84% гуанина, 18% урацила, 28% цитозина, 20% аденина. Определите процентный состав азотистых оснований в участке ДНК, являющегося матрицей для данной иРНК.
Решение. Очевидно, что 34% гуанина в иРНК в смысловой (считываемой) цепи ДНК будут составлять 34% цитозина, соответственно, 18% урацила - 18% аденина, 28% цитозина - 28% гуанина, 20% аденина - 20% тимина (по принципу комплементарности оснований нуклеотидов). Суммарно А + Т и Г + Ц в смысловой цепи будет составлять: А + Т = 18% + 20% = 38%, Г + Ц = 28% + 34% = 62%. В антисмысловой (некодируемой) цепи (ДНК - двухцепочечная молекула) суммарные показатели будут такими же, только процент отдельных оснований будет обратный: А + Т = 20% + 18% - 38%, Г + Ц - 34 % + 28% = 62%. В обеих же цепях в парах комплиментарных оснований будет поровну, т. е. аденина и тимина - по 19%, гуанина и цитозина по 31%.
6. Цепь А инсулина быка в 8-м звене содержит аланин, а лошади - треонин, и 9-м анонс; соответственно серии и глицин. Что можно сказать о происхождении инсулинов?
Решение. Посмотрим, какими триплетами в иРНК кодируются упомянутые в условии задачи аминокислоты, и для удобства сравнения составим небольшую таблицу:
|
Бык |
Лошадь |
|
|
8- е звено белка |
АЛЛ |
ТРЕ |
|
ИРНК |
ГЦУ |
АЦУ |
|
9- е звено белка |
СЕР |
ГЛИ |
|
ИРНК |
АГУ |
ГГУ |
Поскольку аминокислоты кодируются разными триплетами, взяты триплеты, минимально отличающиеся друг от друга. В данном случае у лошади и быка в 8-м и 9-м звеньях изменены аминокислоты в результате замены первых нуклеотидов в триплетах иРНК: гуанин заменен на аденин (или наоборот). В двухцепочечной ДНК это будет равноценно замене пары Ц-Г на Т-А (или наоборот). Следовательно, отличия цепей А инсулина быка и лошади обусловлены транзициями в участке молекулы ДНК, кодирующей 8-е и 9-е звенья цепи А инсулинов быка и лошади.
Страница 3
1. По принципу комплементарности выстраивает вторую цепь данной молекулы ДНК: Т-Т-Ц-А-Г-А-Т-Т-Г-Ц-А-Т-А.
2. Зная длину одного нуклеотида (0,34 нм) определяем длину данного фрагмента ДНК (в ДНК длина одной цепи равна длине всей молекулы): 13х0,34 = 4,42 нм.
3. Рассчитываем процентное содержание нуклеотидов в данной цепи ДНК:
13 нуклеотидов – 100%
5 А – х%, х=38% (А).
2 Г – х%, х=15,5% (Г).
4 Т – х%, х=31% (Т).
2 Ц – х%, х=15,5% (Ц).
Ответ: Т-Т-Ц-А-Г-А-Т-Т-Г-Ц-А-Т-А; 4,42 нм; А=38%; Т=31%; Г=15,5%; Ц=15,5%.
Задача 21. На фрагменте одной цепи ДНК нуклеотиды расположены в последовательности: А-А-Г-Т-Ц-Т-А-Ц-Г-Т-А-Т.
1. Нарисуйте схему структуры второй цепи данной молекулы ДНК.
2. Какова длина в нм этого фрагмента ДНК, если один нуклеотид занимает около 0,34 нм?
3. Сколько (в %) содержится нуклеотидов в этом фрагменте молекулы ДНК?
1. Достраиваем вторую цепь данного фрагмента молекулы ДНК, пользуясь правилом комплементарности: Т-Т-Ц-А-Г-А-Т-Г-Ц-А-Т-А.
2. Определяем длину данного фрагмента ДНК: 12х0,34=4,08 нм.3. Рассчитываем процентное содержание нуклеотидов в этом фрагменте ДНК.
24 нуклеотида – 100%
8А – х%, отсюда х=33,3%(А);
т.к. по правилу Чаргаффа А=Т, значит содержание Т=33,3%;
24 нуклеотида – 100%
4Г – х%, отсюда х=16,7%(Г);
т.к. по правилу Чаргаффа Г=Ц, значит содержание Ц=16,6%.
Ответ: Т-Т-Ц-А-Г-А-Т-Г-Ц-А-Т-А; 4,08 нм; А=Т=33, 3%; Г=Ц=16,7%
Задача 22. Каков будет состав второй цепочки ДНК, если первая содержит 18% гуанина, 30% аденина и 20% тимина?
1. Зная, что цепи молекулы ДНК комплементарны друг другу, определяем содержание нуклеотидов (в %) во второй цепи:
т.к. в первой цепи Г=18%, значит во второй цепи Ц=18%;
т.к. в первой цепи А=30%, значит во второй цепи Т=30%;
т.к. в первой цепи Т=20%, значит во второй цепи А=20%;
2. Определяем содержание в первой цепи цитозина (в %).
определяем долю цитозина в первой цепи ДНК: 100% – 68% = 32% (Ц);
если в первой цепи Ц=32%, тогда во второй цепи Г=32%.
Ответ: Ц=18%; Т=30%; A=20%; Г=32%
Задача 23. В молекуле ДНК насчитывается 23% адениловых нуклеотидов от общего числа нуклеотидов. Определите количество тимидиловых и цитозиловых нуклеотидов.
1. По правилу Чаргаффа находим содержание тимидиловых нуклеотидов в данной молекуле ДНК: А=Т=23%.
2. Находим сумму (в %) содержания адениловых и тимидиловых нуклеотидов в данной молекуле ДНК: 23% + 23% = 46%.
3. Находим сумму (в %) содержания гуаниловых и цитозиловых нуклеотидов в данной молекуле ДНК: 100% – 46% = 54%.
4. По правилу Чаргаффа, в молекуле ДНК Г=Ц, в сумме на их долю приходится 54%, а по отдельности: 54% : 2 = 27%.
Ответ: Т=23%; Ц=27%
Задача 24. Дана молекула ДНК с относительной молекулярной массой 69 тыс., из них 8625 приходится на долю адениловых нуклеотидов. Относительная молекулярная масса одного нуклеотида в среднем 345. Сколько содержится нуклеотидов по отдельности в данной ДНК? Какова длина ее молекулы?
1. Определяем, сколько адениловых нуклеотидов в данной молекуле ДНК: 8625: 345 = 25.
2. По правилу Чаргаффа, А=Г, т.е. в данной молекуле ДНК А=Т=25.
3. Определяем, сколько приходится от общей молекулярной массы данной ДНК на долю гуаниловых нуклеотидов: 69 000 – (8625х2) = 51 750.
4. Определяем суммарное количество гуаниловых и цитозиловых нуклеотидов в данной ДНК: 51 750:345=150.
5. Определяем содержание гуаниловых и цитозиловых нуклеотидов по отдельности: 150:2 = 75;
6. Определяем длину данной молекулы ДНК: (25 + 75) х 0,34 = 34 нм.
Ответ: А=Т=25; Г=Ц=75; 34 нм.
Задача 25. По мнению некоторых ученых общая длина всех молекул ДНК в ядре одной половой клетки человека составляет около 102 см. Сколько всего пар нуклеотидов содержится в ДНК одной клетки (1 нм = 10–6 мм)?
1. Переводим сантиметры в миллиметры и нанометры: 102 см = 1020 мм = 1 020 000 000 нм.
2. Зная длину одного нуклеотида (0,34 нм), определяем количество пар нуклеотидов, содержащихся в молекулах ДНК гаметы человека: (102 х 107) : 0,34 = 3 х 109 пар.
Ответ: 3´109 пар.
Задача 26. Напишите формулы дипептидов, образованных:
а) тирозином и цистеноином; б) серином и фенилаланином; в) глицином и цистеином.
Задача 27. Из метана получите глицин, не используя другие углесодержащие вещества.
Лекция № 2. Репликация ДНК
Согласно гипотезе Дж. Уотсона и Ф. Крика, каждая из цепей двойной спирали ДНК служит матрицей для репликации комплементарных дочерних цепей. При этом образуются две дочерние двухцепочечные молекулы ДНК, идентичные родительской, причем каждая из этих молекул содержит одну неизменную цепь родительской ДНК. Этот механизм репликации ДНК, названный полуконсервативным, был подтвержден в опытах на клетках Е. соli в 1957 г. М. Мезелсоном и Ф. Сталем. Исключены консервативный способ репликации, при котором одна дочерняя ДНК должна содержать обе исходные цепи, а вторая состоять из двух новосинтезированных цепей, и дисперсивный механизм репликации, при котором каждая дочерняя цепь ДНК состоит из участков родительской и новообразованной ДНК (рис.1, слайд 1).
DIV_ADBLOCK489">
3. процесс является симметричным: матрицами служат обе цепи родительской ДНК; также его можно назвать полуконсервативным;
4. удлинение цепи ДНК (или отдельного ее фрагмента) всегда происходит в направлении от 5’-конца к 3’-концу. Это означает, что очередной новый нуклеотид присоединяется к 3’ –концу растущей цепи. Кроме того, поскольку в любой молекуле ДНК комплементарные цепи антипараллелльны, то и растущая цепь антипараллельна матричной цепи. Следовательно, последняя считывается в направлении 3’→5’ (слайд 2 и 3).
5. неспаренная цепь ДНК, которая служит матрицей, и цепь-затравка, к которой присоединяются новые нуклеотиды;
Процесс репликации осуществляется сложным ферментным комплексом. При репликации ДНК у эукариот на каждой хромосоме работает не один, а сразу большое количество таких комплексов. Т. о. на хромосоме имеется много точек начала репликации ДНК. И удвоение ДНК совершается не последовательно от одного конца до другого, а одновременно во многих местах сразу, что значительно сокращает продолжительность процесса (слайд 5). Репликация распространяется в обе стороны от каждой точки начала репликации, при этом образуются репликативные вилки. Между вилками появляется постепенно расширяющееся «вздутие» или «глазок» - это уже реплицированные отделы ДНК. Соседние «вздутия» в конечном счете сливаются и ДНК оказывается удвоенной.
Ферментный комплекс работает так, что одна из двух синтезируемых им цепей растет с некоторым опережением по сравнению с другой цепью. Соответственно, первая цепь называется лидирующей, а вторая – запаздывающей. Лидирующая цепь образуется ферментным комлексом в виде непрерывного очень длинного фрагмента. Его длина (например для сперматогоний) 1 600 000 нуклеотидовю запаздывающая же цепь образуется в виде серии коротких фрагментов – примерно по 1 500 нуклеотидов. Это т. н. фрагменты Оказаки.
Образованию каждого фрагмента ДНК предшествует синтез короткой последовательности (из 10-15 нуклеотидов) РНК-затравки. Дело в том, что ДНК-полимераза (основной фермент синтеза ДНК) не может начинать процесс «с нуля», т. е. в отсутствие олигонуклеотидной прследовательности. А вот фермент синтеза РНК (РНК-полимераза) такой способность обладает; и этот фермент и начинает образование каждого нового фрагмента ДНК.
Ферменты и белки, участвующие в синтезе ДНК: ДНК-полимеразы, топоизомеразы (гиразы), хеликазы и лигазы, праймаза, ssb-белки. Весь комплекс, состоящий более чем из 20 репликативных ферментов и факторов, называется ДНК-репликазной системой, или реплисомой.
ДНК-зависимые ДНК-полимеразы – ключевые ферменты репликативного процесса, использующие принцип комплементарности для наращивания полинуклеотидных цепей. У прокариот есть три ДНК-полимеразы: Pol I, Pol II и Pol III. В репликации ДНК участвуют Pol I и Pol III. ДНК-полимераза I обладает полимеразной и (3’→5’, 5’→3’)-экзонуклеазной активностью, участвует в удалении праймера, застройке бреши, образовавшейся на месте праймера, коррекции ошибок при репликации, а также в репарации ДНК. В клетках E. coli насчитывается около 400 молекул этого фермента. Pol III осуществляет репаративный синтез ДНК.
Основным ферментом, катализирующим биосинтез новообразованной ДНК у прокариот, является ДНК-полимераза III (Pol III). Она обладает полимеразной и 3’→5’- экзонуклеазной активностью; синтезирует лидирующую и отстающую цепь ДНК, обладает корректорской функцией. В клетке содержится 10-20 молекул Pol III, она обладает повышенным сродством к матрице и обеспечивает высокую эффективность копирования.
Активация" href="/text/category/aktivatciya/" rel="bookmark">активации ДНК-полимеразы.
Возникает вопрос, зачем ДНК-полимеразе III 2 типа активности: полимеразная и 3¢→5¢ экзонуклеазная? Дело в том что, точность копирования при репликации ДНК очень высока - на миллиард пар оснований приходится приблизительно одна ошибка. Однако в нормальной ДНК возникают на короткое время редкие таутомерные формы всех четырех оснований. Эти формы образуют неправильные пары. Например, таутомерная форма цитозина спаривается с аденином вместо гуанина, в результате чего возникает мутация (слайд). Значит, высокая точность репликации определяется механизмом, который осуществляет коррекцию, т. е. устранение подобных ошибок. Вот здесь-то и используется 3¢→5¢-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы III. Вступив в контакт с молекулой ДНК, имеющей неспаренный с аденином цитозин, ДНК-полимераза III отщепляет (путем гидролиза) любые неспаренные нуклеотиды.
Имеются доказательства того, что ДНК-полимераза III катализирует сопряженный синтез ведущей (лидирующей) и отстающей цепей ДНК при репликации. ДНК-полимеразы нуждаются в затравке (праймере), поскольку они могут присоединять дезоксирибонуклеотиды только к 3’-ОН-группе. На лидирующей цепи существует 1 праймер, а на отстающей их больше одного. ДНК-полимераза на отстающей цепи синтезирует короткий фрагмент за 4 с, а затем переключается на синтез другого (следующего) фрагмента на участке матричной цепи, расположенном на некотором расстоянии от первого (слайд).
Для каждого короткого фрагмента ДНК-полимеразе требуется затравка (праймер) со спаренным 3¢-концом. Праймеры синтезируются ферментом ДНК-праймазой, которая формирует из рибонуклеозидтрифосфатов короткие РНК-затравки (праймеры), состоящие у эукариот примерно из 10 нуклеотидов (слайд). Затравки синтезируются с определенными интервалами на матрице отстающей цепи, далее их наращивает ДНК-полимераза, начиная всякий раз новый фрагмент Оказаки. Молекула ДНК-полимеразы продолжает наращивание до тех пор, пока она не достигнет затравки (праймера). Для того чтобы обеспечить непрерывность цепи ДНК из многих таких фрагментов, в действие вступает система репарации ДНК, которая удаляет РНК-затравку и заменяет ее на ДНК. Завершает процесс лигаза, соединяющая3¢-конец нового фрагмента с 5¢-концом предыдущего фрагмента.
Двойная цепь ДНК должна расплетаться по ходу продвижения репликационной вилки, для того чтобы поступающие дезоксирибонуклеозидтрифосфаты могли спариваться с родительской матричной цепью. Однако в обычных условиях двойная спираль ДНК стабильна; спаренные основания соединены настолько прочно, что для разделения двух цепей ДНК в пробирке требуются температуры, приближающиеся к точке кипения воды (90°С). Для того, чтобы двойная спираль раскрылась, необходимы два типа белков: геликазы и SSB-белки.
Белки, подготавливающие родительскую ДНК к репликации
а) Точки начала репликации на молекуле ДНК имеют специфическую последовательность оснований, богатую парами А-Т.
Процесс начинается с того, что с каждой такой последовательностью связывается несколько молекул специальных узнающих белков. В случае бактерий такие белки называются DnаА (как первые белки, инициирующие репликацию). (Поэтому на рис. узнающий белок обозначен буквой А.)
Можно представить различные причины, по которым становится возможным взаимодействие узнающих белков с точками начала репликации. Среди этих причин:
- само появление в ядре узнающих белков или их определенная модификация;
- освобождение точек начала репликации от неких блокирующих элементов;
- появление в ядре каких-то третьих факторов, необходимых для рассматриваемого взаимодействия; и т. д.
Имеющиеся данные свидетельствуют в пользу первого варианта. Но в любом случае ясно, что здесь - одно из ключевых звеньев, контролирующих начало репликации.
Узнающие белки, обеспечив связывание ДНК-реплицирующего комплекса, видимо, далее не перемещаются вместе с ним по ДНК.
б) Одним же из «первопроходцев» выступает фермент геликаза (на рис. обозначен буквой Г). Он обеспечивает расплетение в районе репликативной вилки двойной спирали родительской ДНК: последняя разъединяется на одноцепочечные участки.
На это затрачивается энергия гидролиза АТФ - по 2 молекулы АТФ на разделение 1 пары нуклеотидов.
Видимо, одновременно происходит также вытеснение данного участка ДНК из связи с гистонами и другими хромосомными белками.
в) Однако расплетение спирали на некотором участке создает суперспирализацию перед этим участком.
Дело в том, что каждая молекула ДНК в целом ряде мест зафиксирована на ядерном матриксе. Поэтому она не может свободно вращаться при расплетении какого-то своего участка. Это и вызывает суперспирализацию, а с ней - образование структурного напряжения, блокирующего дальнейшее расплетение двойной спирали.
Проблема решается с помощью ферментов топоизомераз (И на рис.). Очевидно, они функционируют на еще нерасплетенном участке ДНК, т. е. там, где возникает суперспирализация. Топоизомеразы участвуют в процессе раскручивания двойной спирали в репликативной вилке. Эти ферменты изменяют степень сверхспирализации и приводят к образованию «шарнира», который создает условия для непрерывного движения репликативной вилки. Идентифицированы два типа топоизомераз: топоизомеразы I типа надрезают одну из двух цепей ДНК, в результате чего концевой участок двойной спирали может повернуться вокруг интактной цепи, и затем воссоединяют концы разрезанной цепи. Топоизомеразы типа II вносят временные разрывы в обе комплементарные цепи, изменяют степень сверхспирализации, а затем соединяют разорванные концы. Топоизомеразы помогают геликазе раскручивать ДНК для ее репликации. Имеется также топоизомераза II (бактериальная топоизомераза II называется гиразой). Этот фермент разрывает сразу обо цепи ДНК, опять-таки перенося соответствующие концы на себя. Это еще более эффективно позволяет решать проблему супервитков при расплетении ДНК.
Топоизомераза I разрывает одну из цепей ДНК, перенося ее проксимальный конец на себя (рис.). Это позволяет дистальному участку ДНК (от места расплетения до места разрыва) вращаться вокруг соответствующей связи целой цепи, что и предупреждает образование супервитков. Впоследствии концы разорванной цепи вновь замыкаются: один из них переносится с фермента на второй конец. Так что процесс разрыва цепи топоизомеразой легко обратим.
Хеликазы (от лат. helix - спираль, белок dnaB ), осуществляют образование и продвижение вдоль спирали ДНК репликативной вилки – участка молекулы с расплетенными цепями. Эти ферменты для расплетения цепей используют энергию, высвобождающуюся при гидролизе АТР. Хеликазы действуют в комплексе с ssb -белками, которые связываются с одноцепочечными участками молекулы и тем самым стабилизируют расплетенный дуплекс.
г) Итак, «поддерживаемый» топоизомеразами, фермент геликаза осуществляет локальное расплетение двойной спирали ДНК на две отдельные нити.
С каждой из этих нитей сразу связываются специальные SSB-белки. Последние обладают повышенным сродством к одноцепочечным участкам ДНК и стабилизируют их в таком состоянии.
Заметим: тем самым данные белки отличаются от гистонов, которые связываются в первую очередь с двухцепочечными участками ДНК.
Ферменты полимеризации
а) Специальный белок выполняет функции активатора праймазы (АП на рис.). После чего праймаза (П), используя в качестве матрицы соответствующий участок одноцепочечной ДНК, синтезирует короткую РНК-затравку, или праймер.
б) Далее в дело вступают ДНК-полимеразы. У эукариот известно 5 разных ДНК-полимераз. Из них β- и ε-полимеразы участвуют в репарации ДНК, γ-полимераза - в репликации митохондриальной ДНК, а α- и δ-полимеразы - в репликации ядерной ДНК.
При этом, по некоторым предположениям, α-полимераза связана и с праймазой, и с δ-полимеразой, а последняя, в свою очередь, - с белком РСNА (Р на рис.).
Данный белок выполняет роль «прищепки», которая крепит комплекс полимераз к реплицируемой цепи ДНК. Считается, что в «застегнутом» состоянии он, как кольцо, обхватывает цепь ДНК (рис.). Тем самым предупреждается преждевременная диссоциация полимераз от данной цепи.
Понятно, что ДНК-полимеразы осуществляют последовательное включение дезоксирибонуклеотидов в строящуюся цепь ДНК - комплементарно нуклотидам родительской цепи.
Но, кроме того, эти ферменты, видимо, имеют и ряд других важных активностей. Правда, для эукарио-тических ДНК-полимераз распределение данных активностей еще не вполне ясно. Поэтому приведем сведения относительно аналогичных бактериальных ферментов.
У бактерий основную «работу» по репликации ДНК выполняет ДНК-полимераза III, имеющая структуру димера. Именно с ней связан «зажим» типа белка РСNА.
Так вот, помимо ДНК-полимеразной активности, ДНК-полимераза III обладает еще одной - 3"→5"-экзонуклеазной. Последняя срабатывает в тех случаях, когда допущена ошибка и в строящуюся цепь включен «неправильный» нуклеотид. Тогда, распознав дефект спаривания оснований, фермент отщепляет с растущего (3"-) конца последний нуклеотид, после чего опять начинает работать как ДНК-полимераза.
Таким образом, происходит постоянный контроль системы за результатом своей деятельности.
в) Как мы знаем, новые цепи ДНК образуются вначале в виде фрагментов - относительно коротких (фрагментов Оказаки) и весьма длинных. И каждый из них начинается с праймерной РНК.
Когда ферментный комплекс, движущийся по родительской цепи, доходит до РНК-затравки предыдущего фрагмента, «зажим», связывающий ДНК-полимеразу III с родительской цепью ДНК, раскрывается, и данный фермент прекращает работу. В действие вступает ДНК-полимераза I (речь по-прежнему идет о бактериальных ферментах). Она присоединяется к З"-концу растущего фрагмента (рис. 1.14). При этом фермент уже не имеет устойчивой связи с данным фрагментом и с родительской цепью, но зато обладает даже не двумя, а тремя активностями.
Первая из них - «передняя», или 5"→3"-экзонуклеазная активность: последовательное отщепление нуклеотидов с 5"-конца РНК-затравки предшествующего фрагмента.
Концу «своего» фрагмента (ДНК-полимеразная активность).
И, наконец, подобно ДНК-полимеразе III, он «не забывает» проверять и при необходимости корректировать свою деятельность - с помощью «задней», или 3"→5"-экзонуклеазной, активности, направленной на удлиняемый фрагмент.
Функция ДНК-полимеразы I исчерпывается, когда растущий фрагмент вплотную доходит до дезоксирибонуклеотидов предыдущего фрагмента.
Что касается эукариот, то здесь функциональным аналогом бактериальной ДНК-полимеразы III является, видимо, комплекс α- и δ-ДНК-полимераз; при этом корректирующая 3"→5"-экзонуклеазная активность присуща δ-ДНК-полимеразе.
Функции ДНК-полимеразы I тоже распределены между двумя ферментами: 5"→3"-экзонуклеазная активность (удаление РНК-затравки) осуществляется, вероятно, специальной нуклеазой (Н на рис. 1.11), а ДНК-полимеразная активность (застраивание «брешей») - ДНК-полимеразой β (той, что участвует и в репарации).
г) Говоря о ферментах полимеризации, нельзя не сказать о самой трудной из связанных с ними проблем. Речь идет о синтезе запаздывающей цепи ДНК: как мы знаем, направление этого синтеза противоположно общему направлению распространения репликативной вилки.
Имеются, по крайней мере, две гипотезы, объясняющее это противоречие.
По одной из них (рис. 1.15, А), ферментный комплекс периодически прекращает образование лидирующей цепи, переходит на вторую родительскую цепь и синтезирует очередной фрагмент Оказаки запаздывающей цепи. Затем вновь возвращается на первую родительскую цепь и продолжает удлинять лидирующую цепь строящейся ДНК.
По другой версии (рис. 1.15, Б), на второй цепи родительской ДНК (матрице запаздывающей цепи) в процессе репликации формируется петля. Поэтому направление образования фрагмента Оказаки на внутреннем участке петли начинает совпадать с направлением движения полимеразного комплекса. Тогда последний может практически одновременно образовывать сразу обе цепи ДНК - и лидирующую, и запаздывающую.
Возможно, с этим связан тот факт, что бактериальная ДНК-полимераза III является димером, а у эукариот α- и δ-ДНК-полимеразы образуют единый комплекс. Но и при таком механизме запаздывающая цепь, как нетрудно убедиться, не может образовываться непрерывно, а только в виде фрагментов.
Ферменты, завершающие репликацию ДНК
В результате действия всех предыдущих ферментов каждая иовосинтезированная цепь оказывается состоящей из фрагментов, вплотную примыкающих друг к другу.
«Сшивание» соседних фрагментов осуществляется ДНК-лигазой (Л на рис. 1.11). Как и ДНК-полимеразы, этот фермент образует межнуклеотидную (фосфодиэфирную) связь.
Но если в полимеразной реакции одним из участников является свободный дНТФ (дезоксирибонуклеозидтрифосфат), то в ДНК-лигазной реакции оба участника - концевые дНМФ (дезоксирибонуклеозидмонофосфаты) в составе «сшиваемых» фрагментов.
По этой причине энергетика реакции иная, и требуется сопряженный гидролиз молекулы АТФ.
Заметим также, что ДНК-лигаза «сшивает» только такие одноцепочечные фрагменты, которые находятся в составе двухцепочечной ДНК.
Но и это еще не все. Молекула ДНК окажется реплицированной не полностью, если не произойдет специальный процесс репликации ее концов, или теломерных участков.
В этом процессе ключевую роль играет фермент теломераза.
Праймазы. Репликация ДНК требует РНК-праймеров. РНК-праймеры синтезируются праймазой (рис. 29.3), кодируемой dnaG геном.
Из рис 29.3 видно, что праймаза состоит из трех доменов:
■ – N-терминальный домен (110 аминокислот), содержит ДНК-связывающий мотив - цинковый палец;
■ – коровый (центральный) домен (322 аминокислоты) содержит каталитический центр;
■ – С-терминальный домен (151 аминокислота), взаимодействующий с dnaB.
Праймеры, синтезируемые праймазой E. coli, начинаются с последовательности pppAG на 5´-конце и состоят примерно из 10-12 нуклеотидов. Праймазы различаются как по структуре, так и по специфичности действия.
ДНК-лигазы катализируют процессы воссоединения фрагментов цепей ДНК, участвуя в образовании ковалентных связей между 5_-Р - и 3_-ОН-группами соседних дезоксирибонуклеотидов. Эти ферменты также используют энергию макроэргических связей, образующуюся при гидролизе АТР.
Репликация ДНК идет в три стадии: инициация, элонгация и терминация .
У бактерий инициация репликации ДНК начинается в уникальном сайте хромосомы, точке репликации – oriC, из которой репликация осуществляется двунаправлено до точки окончания (terminus). В результате образуются две репликативные вилки, которые продвигаются в противоположных направлениях, т. е. обе цепи реплицируются одновременно.
Инициаторный белок dnaA связывается с повторяющимися сайтами связывания на oriC , образуя специализированную нуклеопротеиновую структуру. Это приводит к локальному расхождению АТ-богатой последовательности oriC , которая служит зоной связывания для репликативной хеликазы (dnaB) , и белка dna C /
Далее dnaB активируется удалением dnaC , движется на определенное расстояние в направлении 5_→3_ и взаимодействует с праймазой dnaG . Праймаза синтезирует короткие РНК-праймеры для холофермента ДНК-полимеразы Ш. В месте инициации образуется промежуточный комплекс, состоящий по меньшей мере из пяти белков. Один из них – белок dnaB – может передвигаться вдоль ДНК, используя энергию гидролиза АТР, а также служит сигналом для активации праймазы (рис. 29.5).
Праймаза является компонентом праймосомы, состоящей из нескольких различных субъединиц. В состав праймосомы входит также комплекс белков DnaВ и DnaС , который вблизи репликационной вилки периодически участвует в формировании специфической вторичной структуры ДНК, подходящей для узнавания праймазой.
Инициация репликации ДНК заканчивается образованием репликативной вилки и синтезом РНК-затравки на лидирующей цепи ДНК (рис.29.5) благодаря формированию репликационного комплекса (рис.29.6).
В процессе элонгации происходит наращивание дочерних полинуклеотидных цепей ДНК. Каждая репликативная вилка включает, по крайней мере, две молекулы ДНК-полимеразы III, ассоциированные с несколькими вспомогательными белками. К последним относятся ДНК-топоизомеразы (гиразы), которые раскручивают плотно свернутую двойную спираль ДНК, и хеликазы, которые расплетают двухтяжевую ДНК на две цепи.
Ведущая цепь ДНК реплицируется непрерывно в направлении, совпадающем с движением репликативной вилки. Отстающая цепь считывается в направлении, противоположном движению репликативной вилки. Преодоление антипараллельности цепей ДНК при репликации, возможно, достигается путем образования петельной структуры (рис. 29.7).
Вначале на отстающей цепи синтезируются короткие фрагменты новой цепи ДНК, так называемые фрагменты Оказаки, названные так по имени их первооткрывателя. Каждый фрагмент начинается с короткой РНК-затравки (праймера), необходимой для функционирования ДНК-полимеразы. ДНК-полимераза III достраивает этот праймер до фрагмента ДНК длиной 1000-2000 дезоксинуклеотидных звеньев.
